□ 張 帆 陶 濤 王水明 文/圖
“埃博拉病毒檢測技術儲備研究”建立的針對埃博拉病毒及其5種亞型的檢測方法，為我國埃博拉病毒防控提供了第一手資料及技術手段，這將有助于我國對出入境貿易商品中攜帶EBV進行科學評價，對進出境人員、易感動物進出境的EBV預警防控提供必要的檢測技術儲備。
檢測人員確認PCR是首選檢測技術
實驗人員對檢測結果進行照相分析
技術人員制備被檢樣品
江蘇南京檢驗檢疫局主持的江蘇檢驗檢疫局科研項目“埃博拉病毒檢測技術儲備研究”近日順利通過鑒定。鑒定會上，鑒定委員會聽取了課題組的研究工作匯報，審閱相關材料并進行了質詢，經評議后一致認為，課題組建立的針對埃博拉病毒及其5種亞型的檢測方法，具有良好的敏感性、穩(wěn)定性和重復性，對外來病防控和出入境動物產品檢驗檢疫具有重要意義，應用前景廣闊，其成果達到國際先進水平。
技術儲備 刻不容緩
埃博拉出血熱（Ebola haemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBV）引起的急性多器官溶血性疾病，屬于動物疫源性傳染病，人的病死率高達80％，是人類目前已知最為烈性的傳染病之一。由于該病最初是在蘇丹和扎伊爾間的埃博拉河流域發(fā)生，故稱為埃博拉血熱。
EBV通過干擾感染者機體凝血平衡，導致血管壁破壞或功能受損，血小板不能凝血，在2至21天內出現(xiàn)出血性休克或器官衰竭。人感染EBV，主要表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐；有出血趨勢和偶爾的休克癥狀，皮膚丘疹，胃腸道、呼吸道和器官瘀血、出血。由于體內器官壞死、分解，病人不斷把壞死組織從口中嘔出，最后多因廣泛性內出血、腦部受損等原因而死亡，世界衛(wèi)生組織已將EBV列為對人類危害最嚴重的病毒之一。
由于EBV危害程度分類為第一類，其病毒培養(yǎng)、動物感染等試驗必須在生物安全四級實驗室進行，未經培養(yǎng)的感染材料在生物安全三級實驗室，滅活材料在生物安全二級實驗室進行。世界上僅有少數(shù)幾個國家的實驗室能開展埃博拉病毒的研究，主要集中在美國亞特蘭大的CDC。我國在埃博拉出血熱的檢測研究上還基本上屬于空白。
雖然目前我國境內并沒有出現(xiàn)EHF的暴發(fā)，也不存在EBV。但是由于我國與外國貿易往來不斷增多，尤其是與非洲各國的交往比以往更為頻繁，EBV極有可能通過潛伏期病人或者隱性感染者以及感染的動物傳入我國。EHF若暴發(fā)將帶來難以估計的危害。加快EBV檢測技術的儲備，建立快速、準確、特異的EBV實驗室檢測方法，對于口岸衛(wèi)生檢疫、動物及動物產品檢疫具有重要意義。檢測技術儲備，刻不容緩！
攻堅克難 創(chuàng)造領先
得到免疫性良好檢測抗原，避免使用全病毒所帶來的巨大風險，首先要制備檢測抗原。在EBV核酸檢測時，一般選擇高度保守糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）作為擴增靶標進行設計引物或探針，課題組正是在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進行引物設計，實驗結果表明具有很高的特異性。由于我國現(xiàn)在還沒有感染EBV的臨床樣品，并嚴禁EBV的操作，課題組創(chuàng)新性地采用體外合成的辦法獲得目的基因，采用基因摻入法制備被檢樣品，并模擬樣品病毒滅活過程。
選擇適合我國情況的檢測方法。國外報道建立對EBV的多種檢測方法，如病毒分離、電鏡觀察、RT-PCR、Real-time PCR、PCR、ELISA、捕捉ELISA、血凝試驗、間接免疫熒光、Western blot等，從現(xiàn)場應用結果來看，RT-PCR方法具有快速、敏感的優(yōu)點，結合我國實際情況，PCR仍是最理想的首選檢測技術。
EBV與多種出血熱病毒有較近親緣性，尤其是馬爾堡病毒（Marburg Virus，MARV）同屬絲狀病毒屬。為了攻克這一難關，研究小組在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進行引物設計，采用特異性較強的套式PCR方法，在經歷上百次失敗后，成功設計出合適的引物，進而經過反復摸索，優(yōu)化反應條件，最終成功建立套式RT-PCR方法。該項方法不僅具有良好特異性，能區(qū)分EBV和MARV，而且具有高敏感性，可以檢測10pg的病毒RNA，將檢測敏感度提高了1000倍。
病毒亞型之間的同源性遠遠高于不同病毒之間，即使是國際上，目前也僅能對EBV的扎伊爾亞型、蘇丹亞型和本迪布焦亞型三種亞型進行區(qū)分，尚無檢測萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型方法的報道。研究組明知山有虎，偏向虎山行。在吸收國外成功經驗的基礎上，結合掌握的資料和前期的經驗，采用Taqman Real-time RT-PCR技術，成功建立了分別檢測5種亞型的檢測方法，其中對萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型的檢測方法為國際首創(chuàng)。這一研究成果，不僅填補了國內外的研究空白，也具有重要的應用價值，對于疾病的治療、病原的追溯、疾病的防控具有重要意義。
成果初現(xiàn) 走向應用
課題組利用建立的檢測方法，對緬甸地區(qū)兩個縣，涉及3個科，5個屬的853只蝙蝠進行了熒光定量EBV檢測，結果全部陰性；共收集全國15個�。ㄊ�、區(qū)）豬臨床樣品920份，被采集臨床樣品的豬都表現(xiàn)出豬瘟、豬藍耳病、豬偽狂犬病、豬流感或豬流行性腹瀉病疑似癥狀，對這些樣品進行了EBV RT-PCR檢測和萊斯頓亞型EBV檢測，結果全部為陰性。通過臨床樣品的檢測，一方面驗證了檢測方法的穩(wěn)定性和重復性，另一方面，這是國內首次針對EBV的流行病學調查，這為我國EBV的防控提供了第一手資料。
課題組在研究過程中，發(fā)表研究論文10篇，研究的“一種檢測埃博拉病毒的熒光定量PCR檢測方法及其引物和試劑盒”和“一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒”申請國家發(fā)明專利，目前已成功受理。
該項目研究的5種亞型EBV的RT-PCR檢測方法、SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測方法及單獨檢測每一基因亞型的EBV熒光定量RT-PCR檢測方法適用于大規(guī)模EBV流行病學調查，具有簡單、快速、敏感的優(yōu)點，將為進出口動物檢疫，EBV易感動物監(jiān)測提供簡單、快捷的檢測工具。
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（Ebola virus）又譯作伊波拉病毒，是一種能引起人類和靈長類動物產生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒。埃博拉病毒的名稱出自非洲扎伊爾的“埃博拉河”。
這種病毒來自“Filoviridae”族，與馬爾堡病毒類似�！鞍２├辈《臼且环N十分罕見的病毒，這種病毒最早是于1967年在德國的馬爾堡首次發(fā)現(xiàn)的，但當時并沒有引起人們的注意。1976年在蘇丹南部和扎伊爾即現(xiàn)在的剛果（金）的埃博拉河地區(qū)再次發(fā)現(xiàn)它的存在后，才引起醫(yī)學界的廣泛關注和重視，“埃博拉”由此而得名。在大約1500例確診的埃博拉案例中，死亡率高達88%。目前沒有有效的特效療法，也沒有埃博拉病毒的疫苗。
《中國國門時報》
